TFF filtraj tanjansyèl koule konbine avèk ultracentrifugation pou preparasyon efikas ti vesikil ekstraselilè

Ti vesik ekstraselilè (sEVs) se vesik nanokal ki sekrete pa selil ki gen asid nikleyik, pwoteyin, ti molekil, ak lòt konpozan, epi jwe yon wòl enpòtan nan kominikasyon entèselilè. Ti vesik ekstraselilè kalite exosome-yo gen gwo resanblans ak selil paran yo. Konpare ak nanopartikil atifisyèl yo, yo montre pi ba pousantaj clearance iminitè ak pi ba cytotoxicity, ki fè yo kandida pwomèt kòm roman.an vivo machin livrezon dwòg. Prèske tout kalite selil ka sekrete vesik sa yo, ak rechèch sou aplikasyon yo kòm transpòtè dwòg piti piti deplase soti nan laboratwa a nan direksyon aplikasyon klinik. Sepandan,gwo -pwodiksyon echèl rete yon gwo blokaj.

 

Metòd aktyèl pou izole vesikul ekstraselilè

Metòd izolasyon vesikil ekstraselilè aktyèl yo genyen ladan youltrasantrifugasyon, santrifujasyon gradyan dansite, gwosè{0}}kwomatografi eksklizyon (SEC), ak presipitasyon polyethylene glycol (PEG)..

PEG presipitasyon ofri pwodiksyon segondè ak operasyon senp, men li asosye ak kontaminasyon enpòtan pa pwoteyin vle. Santrifijasyon gradyan dansite ak gwosè-kromatografi eksklizyon ka bay pwodwi pite ki wo, men efikasite yo relativman ba epi pwosesis yo pran tan-. Ultracentrifugation se lajman itilize, men volim pwosesis li yo limite pa kapasite santrifujeur, sa ki fè li difisil pou monte.

 

Aplikasyon Filtrasyon Flow Tanjansyèl pou Separasyon sEV

Tanjansyèl filtraj koule (TFF) te deja aplike nan separasyon nan nanopartikul tankou lipozom ak vektè lentiviral. Nan TFF, manje a ap koule tanjansyèlman atravè sifas manbràn, sa ki ede diminye fouling manbràn epi fè pwosesis la pi fasil pou monte.

Depi ti vesik ekstraselilè jeneralman varye de30-200 nman dyamèt, a0.45 μm kasèt manbrànka chwazi nan sistèm TFF a pou retire pi gwo pwoteyin ak vesik, pandan y ap a300 kDa manbràn kasètka itilize pou retire ti pwoteyin molekilè-yo epi konsantre ti vesik ekstraselilè ki prezan nan mwayen kilti a.

 

Karakterizasyon Materyèl kri apre Separasyon TFF

Nanopatikil Suivi analiz (NTA) te montre ke dyamèt patikil yo te sitou distribiye nan seri a nan0-250 nm.

 

 

Sepandan, mikwoskopi elektwonik transmisyon (TEM) te revele yon gwo kantite pwoteyin kontamine, pandan ke pa gen okenn vesik ekstraselilè yo te obsève. Rezilta sa yo te endike ke yon lòt etap pirifikasyon an te oblije pirifye plis vesik ekstraselilè yo.

 

Karakterizasyon TFF Konsantre apre 100 kDa Ultrafiltrasyon

Te konsantre TFF a plis trete lè l sèvi avèk yon100 kDa tib ultrafiltrasyon.

NTA te montre ke dyamèt patikil yo nan konsantre yo te jwenn apre youn ak de jij ultrafiltrasyon rete sitou nan seri a nan0-250 nm. Sepandan, fè ultrafiltrasyon de fwa te lakòz yon rediksyon enpòtan nan kantite patikil yo jwenn.

Analiz TEM te montre ke pa gen okenn estrikti vesik-tankou yo te obsève nan swa yon sèl-tan oswa de-fwa ultrafiltrasyon konsantre, pandan y ap yon kantite konsiderab nan pwoteyin kontamine rete.

Se poutèt sa,Ultrafiltrasyon 100 kDa pa ta ka efektivman itilize pou pirifye mwayen kilti a apre konsantrasyon TFF.

 

 

Karakterizasyon TFF Konsantre Pirifye pa Ultracentrifugation

NTA te montre ke dyamèt patikil yo nan pwodwi yo pirifye yo te sitou distribye nan seri a nan0-250 nm.

Sa ki enpòtan, TEM te revele klèman estrikti tankou vesik-nan diferan chan de vi. Rezilta sa yo demontre ke apre yo fin konsantre mwayen kilti a lè l sèvi avèk TFF,ultracentrifugasyon ka imedyatman anplwaye pou plis separasyon ak pirifikasyon nan vesik ekstraselilè..

 

 

Karakterizasyon sEV yo izole nan mwayen kondisyone selil souch mezenchymal lè l sèvi avèk TFF konbine avèk ultrasantrifugasyon

NTA te montre ke dyamèt patikil yo nan pwodwi yo pirifye yo te sitou distribye nan seri a nan0-250 nm.

TEM te obsève estrikti vesik-tankou. Analiz Western blot te demontre ekspresyon pozitif nan pwoteyin ki asosye ak vesikil ekstraselilè a-CD9, CD63, ak ALIXnan vesik ekstraselilè ki pirifye.

Rezilta sa yo te konfime ke ti vesik ekstraselilè ki pirifye yo te genyen exosomes, ki endike ke metòd sa a ka itilize tou pouizolasyon eksozòm ak ekstraksyon.

 

 

Konklizyon: TFF konbine avèk ultracentrifugasyon pou preparasyon sEV{0}}wo kalite

Etid la te demontre saTFF konsantrasyon pou kont lite lakòz yon pwodwi ki gen yon kantite konsiderab nan pwoteyin kontamine epi se poutèt sa li te ensifizan pou jwenn vesik ekstraselilè ki kalifye.

Menm jan an tou, lè l sèvi avèk yonTib ultrafiltrasyon 100 kDa pou pirifikasyon segondèpa t efikasman bay estrikti vesik entak.

Lè w konbine konsantrasyon TFF ak pirifikasyon ultracentrifugasyon ki vin apre, avantaj tou de teknik yo ka entegre pou jwennbon kalite -ti pwodwi vesikil ekstraselilè.

Konpare ak ultracentrifugasyon konvansyonèl pou kont li, pwosesis la konbine ka efektivmanredwi tan an jeneral pwosesis ak amelyore efikasite separasyon.

Nan workflow sa a,TFF pèmèt anrichisman rapid nan echantiyon gwo-volim yo, adrese limit la nan ultracentrifugasyon konvansyonèl nan pwosesis gwo volim echantiyon. Lè sa a, ultracentrifugasyon fè pirifikasyon pwofon pou retire enpurte pwoteyin ko-konsantre pandan y ap ede kenbe pite ak entegrite vesik yo.

Anplis de sa, pwosesis la pa mande pou ajoute nanreyaktif presipitasyon chimik ekzojèn, ede prezève aktivite byolojik vesik yo nan pi gwo limit posib.

Soti nan pèspektiv nan tradiksyon endistriyèl, pwosesis sa a gen siyifikatifogmante-potansyèlepi li ka ede adrese defi ki asosye ak gwo -pwodiksyon vesik ekstraselilè poulivrezon dwòg, medikaman rejeneratif, ak devlopman pwodwi ki gen rapò. Li bay tou yon baz eksperimantal solid pou optimize pwosesis ki vin apre ak pilòt-manifakti echèl.

 

Referans

Wang Ling, Li Mengshi, Xu Sha, et al.Etablisman yon Metòd pou Separasyon Ti Vezik Ekstraselilè pa Filtrasyon Flow Tanjansyèl Konbine ak Ultracentrifugation. Chinese Journal of Byolojik, 2022, 35(9): 1096–1101. DOI: 10.13200/j.cnki.cjb.003713.